在肿瘤微环境的分析中，涉及的要素众多，关系复杂。我们曾经提到的肿瘤免疫微环境景观分析方案，能对肿瘤组织原位的不同靶标进行精准识别和定量统计，在复杂的肿瘤分析领域表现十分亮眼。
那么今天，就结合一个个案例，来详细地说一说肿瘤免疫微环境景观分析方案是如何取代传统分析方法，成为肿瘤微环境分析的一大杀器的。
肿瘤免疫微环境景观分析方案技术特点
景观分析方法的三个技术突破
景观分析包括三个步骤：
1.多标记免疫荧光染色
（解决一抗抗体来源冲突的问题）；
2.光谱成像和信号拆分
（解决重叠信号串色干扰的问题）；
3.细胞型识别和定量统计
（解决定量分析标准化的问题）。
而在这三个步骤中，分别对应地产生了以下三个突破：
突破1.Opal多色免疫荧光标记试剂盒
TSA酪胺信号放大系统
Opal试剂盒是在TSA基础上开发的一套多标记复染方案，允许在同一样本中使用相同种来源的不同一抗，以顺次单染的方式将各色标记的酪胺共价结合到目标抗原上（抗原直标）随后通过微波加热去除抗体（抗体没了但信号仍留在抗原上）。清除上一轮抗体后即可使用新的抗体继续染色，无需担心交叉反应（Method）。
突破2.Vectra光谱成像和信号拆分技术
光谱成像不同于普通的RGB或荧光成像，系统采集nm—nm范围的所有信号来记录样本上的“颜色”信号，是一种高分辨率的信号记录方法。同一种染料的光谱特征相同，软件据此可以找出画面中与目标光谱曲线一致的所有信号，生成单一通道的目标信号。借助专利的纯光谱算法，即使重叠在一起的多个信号也能有效的区分开来。
突破3.inForm细胞、组织表型识别和定量统计
inForm软件采用流程化的定量病理分析界面，将图像中记录的光谱信号和生物标记物、组织形态信息关联起来，最终将肿瘤组织微环境的多元景观完整、精确的呈现出来。
典型案例：乳腺癌微环境分析（6色）
从这个分析案例中，也能看到这些突破为肿瘤微环境分析带来了巨大的便利。
肿瘤免疫微环境景观分析方案技术优势
组织成像的三个层次需求
基本需求：拍一张精彩的照片！
明场模式下的光谱成像（识别叠加颜色，明场荧光效果互换）
荧光模式下的光谱成像（扣除自发荧光背景，多色荧光成像）
中级需求：对图像结果进行量化比较！
inForm软件可以智能识别不同的组织类型，测量特定组织（如肿瘤、坏死、炎症）的面积；也可以对染色强度进行评分；或者给出两个markers间的共定位比例。
高级需求：组织微环境景观分析(Landscape/Context)
1判断不同蛋白表达水平的相关性
下图显示三种免疫调控蛋白PD-L1、IDO-1、B7-H4的表达相关性，复染CK标识肿瘤组织(SchalperClinCancerRes)
2识别特殊细胞及其功能状态
左图利用CK8和αSMA定义EMT细胞，并用Ki-67判断细胞的增值状态(ZhengNature)
左图利用CD68和CD定义巨噬细胞的特定亚群，进而分析其临床意义和预后价值(ZhangJPathol)
3组织免疫微环境分析（TILs统计分析）
左图标识CD8\CD68\PD1\PD-L1\DAPI显示抗体药物治疗后肿瘤组织的免疫细胞生发中心(NghiemNEnglJMed)
左图标识CD3\CD8\CD20\CK\DAPI显示两种抗体药物联合治疗下小鼠移植瘤处的免疫细胞招募状态(SanmamedCancerRes)
更多标志物选择
肿瘤免疫微环境景观分析方案利用多色标记技术、光谱成像技术和定量病理分析技术，逐步具备了领先的技术优势，而运用到这些技术的代表文章也十分之多，下面就一起来看看吧！
PerkinElmerOpal/TSA多标记染色技术代表文章
Zheng,X.,etal.()."EMTProgramisDispensableforMetastasisbutInducesChemoresistanceinPancreaticCancer."Nature():-30.IF38.
胰腺癌组织，CK8、αSMA、Ki-67，多重标记识别EMT+细胞并判断其增殖状态，显示抑制EMT在肿瘤化疗中的作用。
Pomerantz,M.M.,etal.()."Theandrogenreceptorcistromeisextensivelyreprogrammedinhumanprostatetumorigenesis."NatGenet47(11):-51.IF31.
前列腺肿瘤组织，FOXA1、HOXB13、AR（雄性激素受体），发现三者共定位表达，进而研究两种蛋白在AR顺反组重编程中的作用。
Lovisa,S.,etal.()."Epithelial-to-mesenchymaltransitioninducescellcyclearrestandparenchymaldamageinrenalfibrosis."NatMed21(9):-.IF30.
肾脏纤维化组织，YFP、αSMA、AQP1,识别处于EMT状态的细胞，并判定其AQP1表达情况，进而分析EMT在肾脏纤维化中的作用。
Schalper,K.A.,etal.()."ObjectivemeasurementandclinicalsignificanceofTILsinnon-smallcelllungcancer."JNatlCancerInst(3).IF11.
非小细胞肺癌组织TMA，CK、CD3、CD8、CD20，客观定量TILs并判断其临床预后意义。
Sanmamed,M.F.,etal.()."NivolumabandUrelumabEnhanceAntitumorActivityofHumanTLymphocytesEngraftedinRag2-/-IL2RgammanullImmunodeficientMice."CancerRes75(17):-78.IF8.
小鼠人源胃癌种植瘤组织，CD3、CD8、CD20、CK，借助小鼠模型研究人源抗体药物urelumab和nivolumab的对TILs的作用效果。
Huang,H.,etal.()."Detectingcell-in-cellstructuresinhumantumorsamplesbyE-cadherin/CD68/CD45triplestaining."Oncotarget6(24):-87.IF5.
多种肿瘤组织TMA，E-cadherin,CD68、CD45,多色复染建立识别肿瘤cell-in-cell结构的高效方法。（军医医学科学院）
珀金埃尔默定量病理系统代表文章——定量分析
Liu,Y.,etal.()."TumorExosomalRNAsPromoteLungPremetastaticNicheFormationbyActivatingAlveolarEpithelialTLR3to
小鼠肺癌组织，HE染色(左)，软件智能识别肺部转移瘤的灶点数目（Nodules，中）和癌灶区域面积（metastaticburden，右），精准定量分析小鼠体内移植瘤的转移效率。(第二军医大学）
Oguejiofor,K.,etal.()."StromalinfiltrationofCD8Tcellsisassociatedwithimprovedclinicalout白癜风的治疗药物北京治疗白癜风哪家医院便宜
