Biomaterials光治疗和抗G

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光治疗和抗GITR抗体协同提高原位肿瘤治疗疗效的同时实现对远端转移肿瘤的抑制

大家好，今天给大家推荐的是最近发表在Biomaterials上的一篇文章，本文的通讯作者是北京大学齐宪荣教授。

尽管治疗方法有了巨大的发展，恶性肿瘤的死亡率仍然很高。转移和复发以及化疗和放疗对正常细胞的毒性是影响肿瘤治疗的主要因素。免疫治疗是近年来研究热点之一，其目的是通过自身免疫激活人体免疫系统，杀伤癌细胞。检查点抑制剂(抗pd-1/抗ctla-4)在早期临床试验中显示出了良好的结果，然而，由于T细胞功能障碍的短暂逆转和肿瘤微环境中各种免疫抑制机制限制抗肿瘤淋巴细胞，大多数患者不能产生持久的抗肿瘤反应。

包括光热疗法（PTT）和光动力疗法（PDT）在内的光疗已在癌症治疗中带来了广阔前景。可以通过简单的操作和无创的方式将光疗控制在仅发生在癌症部位，从而将对正常细胞的副作用降到最低。在近红外（NIR）辐射下，光热剂或光敏剂吸收光并产生局部热疗或活性氧（ROS）以消融肿瘤或诱导肿瘤凋亡。或者，分别由PTT和PDT产生的热疗和ROS也可能产生损伤相关的分子模式（DAMP），例如热休克蛋白（HSP），钙网蛋白（CRT）和高迁移率族1蛋白（HMGB1），从而诱导免疫原性细胞死亡（ICD）效应可促进机体对消融性癌症的免疫反应。然而，ICD作用的活性受到免疫抑制性TME和有关适应性免疫抵抗的其他机制的限制。单独的ICD作用可能无法实现强大的免疫治疗和对癌症的全面作用。

众所周知，TME中有许多免疫抑制细胞。调节性T细胞（Tregs），是控制体内自身免疫反应并参与各种免疫调节过程的T细胞的一个子集。Tregs是抗肿瘤免疫的强有力的抑制剂，有助于免疫抑制性TME的进化。因此，近年来，Tregs是免疫治疗领域内治疗干预的目标领域。

因此，为了提高对癌症的治疗效率，必须去除免疫抑制性TME，这是肿瘤治疗道路上的关键障碍。糖皮质激素诱导的癌症坏死因子受体（GITR）是癌症坏死因子受体（TNFR）超家族的共刺激分子，已成为癌症免疫治疗的诱人靶标。GITR在Treg的表面上组成性表达。活化的GITR将抑制Treg的免疫抑制功能并促进效应T细胞（Teffs），从而增强细胞和体液免疫力。

关于这些问题，通过合理设计将光疗与抗GITR免疫疗法相结合的合理设计来扩大抗癌效率并克服癌症治疗中的逆境，这种疗法可以消除肿瘤的免疫抑制作用，并补充ICD对抗转移性癌症的作用。通过光疗原位无创地消融肿瘤。因此，在这项工作中报道了一种多功能的纳米系统，该系统具有基于光疗和免疫疗法的PTT，PDT，ICD效应，抗GITR和影像诊断功能，缩写为PDA-ICG

CAT-DTA-1。在PDA-ICG

CATDTA-1中，仿生聚多巴胺（PDA）在运载各种有效载荷中起一定作用，这取决于类似邻苯二酚胺和其他官能团提供的良好粘合性和表面活性。同时，PDA具有明确的光热作用能力，这是因为其在NIR窗口（–nm）中的光子会增加组织的穿透深度并最小化光损伤。吲哚菁绿（ICG）是由美国食品药品监督管理局（FDA）批准的一种出色的光敏剂，已被纳入以发挥良好的光动力，光热和成像功能。由于PDT的作用受到TME中低氧的限制，因此缓解低氧状态是PDT的一个迫切问题。因此，过氧化氢（H2O2）还原酶过氧化氢酶（CAT）被引入PDA-ICG

CAT-DTA-1作为抗缺氧的杰出候选药物。重要的是，抗GITR抗体DTA-1对Tregs发挥了特殊的靶向作用，以消除肿瘤的免疫抑制并增强光疗引起的ICD效应，从而促进癌症的免疫治疗。我们创新地将光疗与Tregs靶向策略相结合，以减轻免疫抑制并增强ICD效果，

它不仅可以直接杀死原发性癌症，还可以同时抑制外源性癌症。通用纳米系统的结果证明了以下级联功能（图1）可以治疗癌症：（i）在NIR照射下，PTT转化剂和PDT诱导剂在CAT的帮助下均可促进光疗，从而直接杀死原发性癌症。（ii）触发ICD作用以促进免疫调节作用。（iii）同步地，抗GITR抗体（DTA-1）抑制Treg，以进一步消除肿瘤免疫抑制，并诱导更强的T细胞活化，以产生持久的抗肿瘤反应，从而可以控制外源性癌症。（iv）通过ICG整合近红外荧光（NIRF）成像和光声（PA）成像功能可以跟踪纳米系统的分布并评估癌症治疗的进展。总的来说，多功能纳米系统有望增强原发性和绝对性癌症的抗癌效率，从而为癌症治疗铺平了道路。

图1：具有PTT，PDT，ICD效应，抗GITR以及基于光疗和免疫疗法的影像诊断功能的PDA-ICG

CAT-DTA-1纳米系统的示意图

在需氧和弱碱性介质下，通过多巴胺的氧化自聚合制备了聚多巴胺纳米颗粒（PDA）（图2A）。在自聚合过程中，多巴胺溶液的颜色从无色变为浅棕色（0.1h），最后变为黑色（5h），表明PDA的成功形成。通过酸性（pH3）介质中PDA表面的邻苯二酚和胺基，ICG可以通过静电结合和疏水相互作用在面部固定在PDA上以形成PDA-ICG。纳米颗粒中ICG的负载效率和截留效率分别为9.09％和?％。同样，将CAT和抗GITR抗体（DTA-1）进一步引入PDA-ICG，形成具有更多功能的PDA-ICG

CAT-DTA-1。整合ICG，CAT和DTA-1后，PDAICG

CAT-DTA-1的平均流体动力学直径增加到nm左右，而zeta电位保持负值而无明显变化。透射电子显微镜（TEM）（图2B）图像从视觉上显示PDAICG

CATDTA-1是球形的，大小约为nm。PDA-ICG

CAT-DTA-1的粒径和形状在4℃天后仍保持不变（图2C）。

PDA和多巴胺的傅立叶变换红外（FTIR）光谱（图2D）均显示O-H，N-H和NH2拉伸振动在-cm-1范围内，典型的苯环骨架振动在cm-1左右。与多巴胺相比，由于芳香环被取代，PDA在–cm-1处的吸收带明显减弱。此外，PDA在–cm-1的吸收带上存在显着关联。PDA和PDA-ICG

CAT-DTA-1的X射线粉末衍射（XRD）光谱（图S1B）在20°左右显示出相似的X射线峰。图2E展示了CAT和PDAICG

CAT-DTA-1的圆二色性（CD）光谱，在nm和-nm处有相似的特殊峰，突出表明PDA-ICG

CAT-DTA-1中的CAT得以保持它的二级结构。用双金鸡宁酸（BCA）法测得CAT在PDA-ICG

CAT-DTA-1中的负载效率和截留效率分别为8.3％和90.1％。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像（图S1C）证实，由于FITC-DTA-1和ICG在4T1细胞中的合并荧光，DTA-1已成功整合到纳米系统中。UV-vis-NIR光谱（图2F）表明PDA-ICG

CATDTA-1具有ICG，PDA和CAT的典型吸收峰。PDA-ICG

CAT-DTA-1在体外释放的光敏剂(ICG)(图2G)表现出近红外辐射触发的释放模式，表明纳米系统对近红外刺激有良好的响应。

图2：PDA-ICG

CAT-DTA-1的制备和表征。

与游离ICG相比，PDA-ICG

CAT-DTA-1中ICG的荧光强度显着下降，这是因为荧光共振能量转移引起的荧光猝灭。然而，如下所述，PDA-ICG

CAT-DTA-1中的荧光衰减不会导致光热效应（图3A–E）和1O2产生（图3F–J）下降。归因于近红外激发光敏剂的释放（图2G）。纳米系统优选用于能量存储，以提高光疗效率并减少体内对正常组织的意外光毒性。

图3：体外的光热效应和光动力效应。（A）温度升高曲线和（B）在nm激光照射下的相应的代表性实时热像图图像。（C）PDA-ICG

CATDTA-1在激光照射下持续5分钟，冷却过程再持续15分钟的温度记录。（D）关于从（C）中的冷却时间开始的时间（s）与-lnθ之间的关系的线性数据。（E）PDA-ICG

CAT-DTA-1在三个周期的光照射下的光热转化曲线。（F）24小时内游离CAT和PDA-ICG

CAT-DTA-1的酶活性。（G）在激光照射下不同制剂中DPBF的UV-Vis吸光度的变化。（H）直方图表示在游离ICG，PDAICG和PDAICG

CAT-DTA-1激光照射下处理的4T1细胞中ROS水平的荧光强度。（I）在激光照射下用不同处理产生细胞内ROS，（J）相应的ROS统计荧光信号（n＝3）。

图4：体外细胞摄取和定位以及治疗效果。（A）孵育4h后被4T1细胞清除的PDA-ICG

CAT-DTA-1的TEM图像。（B）通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM，比例尺：10μm）成像孵育4h后，有和没有NIR照射后游离ICG和PDA-ICG

CAT-DTA-1的细胞摄取，（C）相应的统计荧光强度。（D）在激光照射下用各种制剂处理24小时的4T1细胞的凋亡分析。（E）在激光照射下不同制剂处理后4T1细胞的死/活测定。（F）用不同制剂未经NIR辐照处理的4T1细胞的细胞活力分析，和（G）经NIR辐照处理。

图5：体内肿瘤归巢和双模式成像。（A）分别静脉注射游离ICG和PDA-ICG

CAT-DTA-1后，对4T1荷瘤小鼠进行近红外荧光成像。黑色圆圈表示肿瘤。（B）分别注射游离的ICG和PDA-ICG

CAT-DTA-1后，在肿瘤部位进行半定量荧光分析。从两个肿瘤获得平均荧光强度。（C）注射免费的ICG和PDA-ICG

CAT-DTA1后24h，主要器官和肿瘤的离体近红外荧光图像和（D）半定量荧光分析。（E）4T1荷瘤小鼠在注射后的光声成像静脉内分别注射游离的ICG和PDA-ICG

CAT-DTA-14小时和24小时。肿瘤以白色圆圈表示。

图6：对用PBS，ICG，PDA，PDA-ICG和PDA-ICG

CAT-DTA-1处理的具有4T1肿瘤的小鼠的抗癌效力。（A）动物肿瘤模型和治疗方案的说明。（B）在静脉内施用不同制剂后5分钟内在激光照射下在原发性肿瘤上的热图像。（C）不同治疗后小鼠中4T1原发性肿瘤和（D）原始肿瘤的相对肿瘤体积-时间曲线（n＝5）。（E）不同处理（n＝7）后的4T1荷瘤小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。（F）在肿瘤切片中分别对TUNEL，HIF-α，CD31（比例尺：25μm），Ki-67和H＆E进行染色（比例尺：μm）。在免疫荧光染色中，细胞核被染成蓝色。

图7：降低PDAICG

CAT-DTA-1的肿瘤免疫抑制作用。（A）肿瘤和（B）血液中FOXP3+/CD4+/CD25+Treg的平均比例分别。（C）肿瘤切片中FOXP3的免疫荧光染色和（D）相应的统计荧光信号（n=3）。比例尺：25μm。细胞核被染成蓝色。（E）小鼠肿瘤中CD8+T细胞/Treg的数量比。（F）小鼠肿瘤中CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的百分比。

图8：重振PDA-ICG

CAT-DTA-1的ICD效果。通过检测（A）CD11c和MHCII的表达以及（B）不同处理后CD11c+/MHCII+细胞的百分比，分析小鼠脾脏中树突状细胞（DC）的成熟度。（C）CRT和HSP70在体外肿瘤细胞和体内肿瘤切片中的免疫荧光染色。细胞核被染成蓝色。比例尺：25μm。体外肿瘤细胞中（D）CRT和HSP70的平均荧光强度和体内肿瘤组织中（E）的平均荧光强度（n=3）。

总之，纳米系统的光疗和抗GITR功能可抑制Treg并增强ICD的作用，从而废除肿瘤的免疫抑制作用并激活有效的免疫功能。因此，这些努力导致针对原发性癌和次生癌的抗癌功效增强。此外，启用的NIRF和PA成像可以准确地监测PDAICG

CAT-DTA-1的生物分布，并有助于癌症的诊断和治疗。所有这些都为PDAICG

CAT-DTA-1在改善癌症治疗方面的应用前景提供了见识。

本文作者：CSS

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